En este proyecto se estudió la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) durante la cicatrización de células de endotelio de córnea bovina en cultivo (BCEC) en porcentaje de confluencia superior al 90%. Se analizó la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) con las sondas dihidro etidio (DHE) y CellROX Green a tiempos cortos (5 a 10 min) y con Amplex RED – HRP a tiempos más largos (30 min a 8h). Se observó la producción de una onda de ROS durante los primeros minutos de realizada la lesión que alcanza 3 a 5 filas de células. Experimentos utilizando inhibidores de NADPH oxidasas (NOX) no evidenciaron cambios en la onda. Sin embargo, los resultados usando MnTnBuOE-2-PyP5+, una manganeso porfirina que se asocia a la mitocondria por sus cargas, inhiben por completo la onda, sugiriendo la formación de superóxido y por consiguiente el posterior incremento de H2O2. Asimismo, experimentos bloqueando la salida de calcio del retículo endoplásmico usando ácido ciclopiazónico o un inhibidor de la fosfolipasa C (U73122) no son suficientes para inhibir la onda, pero la ausencia de calcio extracelular la bloquea casi por completo. Por otro lado, a diferencie de las células 100% confluentes con una semana adicional de maduración de los contactos intercelulares, los estudios con Amplex RED – HRP en tiempos más largos no evidencian cambios en la formación de H2O2 a lo largo de las primeras 8 horas de cicatrización. Para profundizar en el estudio del rol del H2O2 en las condiciones planteadas en este proyecto, se determinó la velocidad de migración y la proliferación celular en presencia de diferentes concentraciones de H2O2 y de inhibidores de NOX. Se obtuvieron resultados que sugieren que tanto el H2O2 como las NOX no intervienen en la modulación de la proliferación celular durante la cicatrización. En su conjunto nuestros resultados sugieren que a diferencia de las BCEC en cultivo con mayor tiempo de confluencias, las células subconfluentes sólo desarrollan la onda inicial de ROS, constituida por superóxido formado en la mitocondria. Se realizaron experimentos midiendo la migración celular durante las primeras 10 horas de cicatrización. Se observó que la incubación con determinadas concentraciones de H2O2 provoca un aumento significativo de la migración mientras que los inhibidores de NADPH oxidasas disminuyen el ratio. No se constataron cambios significativos en cuanto a la proliferación en las diferentes condiciones.
